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La biblioteca occupa due ampie sale al primo piano del cinquecentesco Palazzo del Commendatore, parte del Complesso storico-monumentale dell’Ospedale di Santo Spirito (vedi Galleria Fotografica).
La prima sala è costituita da un atrio e da un vestibolo, dai quali si accede alla sala di lettura. Questa originariamente costituiva la stanza privata del Commendatore Giorgio Spinola, che nel 1711 la cedette, insieme ad altre tre, ad uso della spezieria sottostante.

Il Palazzo fu incluso nel progetto di rinnovamento edilizio del Complesso di Santo Spirito promosso da mons. Bernardino Cirillo (1566-1575) durante il pontificato di Pio V (1566-1572), probabilmente su disegni e sotto la direzione dell’architetto Nanni di Baccio Bigio.
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